蘇州納米所在肺纖維化治療過程中干細胞活體示蹤研究方面取得系列進展
肺纖維化是一種常見的嚴重慢性進行性肺間質疾病，大部分表現(xiàn)為特發(fā)性肺纖維化（IPF），其發(fā)病率和死亡率逐年增加，死亡率高于大多數腫瘤，但目前缺乏有效的治療手段。最近有研究表明，體內移植間充質干細胞可以有效修復該類肺損傷，但具體作用機制尚不清楚，嚴重限制了其臨床應用。針對以上肺纖維化治療臨床難題，中國科學院蘇州納米技術與納米仿生研究所張智軍團隊在國家重點研發(fā)計劃項目、國家自然科學基金以及中國科學院經費支持下，開展了肺纖維化疾病治療過程中的移植干細胞示蹤及作用機理研究。
由于肺部組織的質子密度低等特點，導致磁共振成像（MRI）等技術應用受限，目前臨床上常采用電子計算機斷層掃描（CT）技術進行診斷。由于CT成像靈敏度較低，常需要利用CT示蹤劑對移植干細胞進行標記，實現(xiàn)移植干細胞的體內可視化示蹤。金納米粒子具有較高的X射線吸收性能、良好的生物相容性、容易制備及表面修飾等特點，是進行干細胞標記和CT影像示蹤的理想的納米材料。基于上述考慮，該團隊設計、制備了一系列基于金納米粒子的干細胞示蹤劑，考察了其在肺纖維化治療過程中對移植干細胞示蹤行為。首先研究人員設計、合成了聚賴氨酸與牛血清白蛋白共包覆的金基納米示蹤劑。研究發(fā)現(xiàn)，該納米示蹤劑具有良好的生物相容性、優(yōu)異的CT成像能力以及超高的細胞標記效率。將該金納米示蹤劑標記的間充質干細胞注入肺纖維化小鼠肺部，實現(xiàn)了對肺部移植干細胞長達23天的活體示蹤（Nanoscale, 2019, 11, 20932-20941）。在此基礎上，為了同時考察移植干細胞的體內存活狀態(tài)，研究人員構建了聚乙二醇（PEG）和穿膜肽（TAT）修飾的金納米粒子示蹤劑，利用其對間充質干細胞進行標記，同時結合熒光素酶報告基因，對肺纖維化小鼠體內移植干細胞進行CT和生物發(fā)光（BLI）雙模態(tài)示蹤（圖1）。該工作利用Micro-CT影像技術高穿透深度和高空間分辨率的特點，并借助BLI 高靈敏度以及可識別活細胞的優(yōu)勢，實現(xiàn)了肺纖維化治療中在體移植干細胞的高靈敏度、實時示蹤，并初步探討了干細胞參與肺纖維化治療的再生機制（Small, 2019, 15, 1904314）。
圖1. 外源性Au@TAT納米示蹤劑結合內源性RfLuc報告基因雙重標記hMSCs，通過CT/BLI雙模態(tài)示蹤移植干細胞在肺纖維化模型鼠體內的分布、遷移、存活。
干細胞通過分化或分泌因子對組織器官損傷進行修復是一個長期的過程，因此納米示蹤劑必須具備對其進行長時程CT影像示蹤的能力。但干細胞的胞吐作用以及增殖行為往往導致胞內示蹤劑的濃度逐漸降低，引起CT信號減弱直至消失，難以實現(xiàn)對干細胞的長時程示蹤。鑒于此，研究人員設計、構建了一系列外界刺激響應智能型金納米粒子示蹤劑，有效克服了上述難題。首先通過在Au納米粒子表面修飾一層溫敏性高分子，從而獲得了對溫度敏感的納米示蹤劑（TRAuNPs）（圖2）。在細胞標記溫度39°C條件下，TRAuNPs顯示出小尺寸和疏水特性，有利于細胞膜的黏附和穿透，從而有效提高了示蹤劑的入胞率；而當溫度恢復到正常的生理溫度（37°C）時，TRAuNPs發(fā)生相變，呈現(xiàn)親水性增強且體積變大，有效地減緩了細胞的胞吐速率，延長了納米粒子在胞內的滯留時間，從而達到長時程示蹤的效果。進一步將該納米示蹤劑標記的干細胞移植到肺纖維化小鼠的肺部，利用高分辨率的CT成像和高靈敏度的BLI成像，實現(xiàn)了對移植干細胞的定位、分布和遷移過程長達10天的活體示蹤。（J. Mater. Chem. B, 2021, 9, 2854-2865）。最近該團隊對此策略進行了改進，通過在金納米粒子表面依次修飾pH響應性磺酰胺聚合物PSD和細胞穿膜肽CPP構建了一種pH響應性金納米粒子示蹤劑CPP-PSD@Au。該納米示蹤劑在細胞攝取的過程中經歷細胞內的酸性環(huán)境（內涵體和溶酶體）時，由于PSD的質子海綿效應導致對CPP的靜電吸引減弱，使得納米示蹤劑形成聚集體，從而減緩干細胞對其的外排速度，大大延長了示蹤劑對干細胞的標記時間。在此基礎上，將CPP-PSD@Au標記的間充質干細胞移植到IPF模型鼠體內，實現(xiàn)了對移植干細胞長達35天的動態(tài)CT示蹤，并初步考察了肺纖維化治療過程中干細胞的作用（Small, 2021, 2101861）。該工作發(fā)表后Wiley旗下MaterialsView China立即進行了詳細報道。
圖2. 溫敏性金基納米示蹤劑的制備及其對干細胞的標記與示蹤示意圖。
為了克服單一成像模式的自身缺點，獲得更互補、更豐富的移植干細胞體內信息，該團隊以牛血清白蛋白（BSA）為模板，合成了金/釓納米簇（Au/GdNC），并用二氧化硅（SiO2）殼層將其包覆，構建了Au/GdNC@SiO2納米示蹤劑，對肺纖維化小鼠體內移植干細胞進行CT/MRI雙模態(tài)示蹤（圖3）。結果發(fā)現(xiàn)，SiO2殼層的包覆提高了示蹤劑在標記干細胞胞內的穩(wěn)定性，同時減緩了因干細胞分裂而導致的示蹤劑不斷稀釋的效應，進一步改善了干細胞CT和MRI成像性能（ACS Appl. Bio. Mater. 2020, 3, 2489-2498）。在此基礎上，該團隊還與東南大學醫(yī)學院巢杰教授團隊密切合作，將CT 成像技術與高靈敏度的近紅外熒光（NIRF）成像技術結合，實現(xiàn)了移植干細胞長達21天的CT/NIRF雙模態(tài)影像示蹤。同時進一步揭示了在治療肺纖維化過程中骨髓間充質干細胞通過抑制巨噬細胞活性而對受損肺組織產生抗炎和抗纖維化的作用（J. Mater. Chem. B, 2020, 8, 1713-1727）。
圖3. Au/GdNC@SiO2納米示蹤劑用于移植間充質干細胞CT/MRI雙模態(tài)活體示蹤示意圖。
除了一系列金基CT示蹤劑外，該團隊還與合作者一起設計、構建了聚賴氨酸修飾的近紅外長余輝納米示蹤劑，然后將其與熒光素酶報告基因共同標記的干細胞移植入肺纖維化模型鼠體內，實現(xiàn)了對移植干細胞的位置、遷移、分布以及存活狀態(tài)長達30天的動態(tài)精準示蹤（Biomater. Sci. 2020, 8, 3095-3105）。
該團隊在干細胞納米示蹤方面的上述系列研究受到國際同行的關注。最近他們受邀在國際學術期刊View上發(fā)表了題為“In vivo CT imaging tracking of stem cells labeled with Au nanoparticles”的研究綜述（View, 2021, 20200119），系統(tǒng)介紹了基于金納米粒子的干細胞示蹤劑的理性設計、制備以及體內示蹤應用研究進展，討論并展望了該領域目前存在的主要挑戰(zhàn)及未來可能發(fā)展方向。
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